Dynamik nanoskaliger Partikel an Gefäßwänden

Lars Kreutzburg, Vit Dolezal, Christian Hübner

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Einführung

Der Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe findet an den Wänden der kleinsten Blutgefäße, den Kapillaren statt. Sie haben einen Durchmesser von nur wenigen Mikrometern und bestehen aus einer einfachen Schicht Endothelzellen. An ihrer Zellwand bilden diese Endothelzellen eine Struktur aus Zuckern und Proteinen, die Glykokalyx, welche zusammen mit Teilen des Blutplasmas die Endotheliale Oberflächenschicht (engl. ESL) bildet (1, 2, 3]. Bei ihrem Übergang vom Blut in das Gewebe müssen einzelne Partikel – insbesondere Wirkstoffe -diese Struktur passieren. Obgleich die Zusammensetzung und Eigenschaften, z.B. Mechanik und Permeabilität gut erforscht sind, gibt es kaum Messungen zur Dynamik einzelner Moleküle in diesem Bereich des Blutkreislaufs.

ABBILDUNG 1. SCHEMATISCHE DARSTELLUNG DER ENDOTHELIALE OBERFLÄCHENSCHICHT

Das Teilprojekt C des Forschungskollegs LUMEN untersucht in diesem Zusammenhang zwei grundsätzliche Fragen: Wie bewegen sich einzelne Moleküle direkt auf der Endothelialen Oberflächenschicht? Denkbar wären hier etwa rollende Bewegungen oder ein ,Hüpfen‘ als Übergang vom konvektiven Transport im Blutstrom zur Diffusion im Gewebe. Und: Wie bewegen sich die Teilchen schließlich in der ESL? Hier ist davon auszugehen, dass die Diffusion der Teilchen durch die ESL eingeschränkt und dadurch möglicherweise auch anisotrop ist.

Zur Klärung dieser Fragestellungen eignet sich die Fluoreszenz­Korrelations-Spektroskopie (engl. FCS) besonders gut. Sie erlaubt die Messung von Diffusionskoeffizienten, Geschwindigkeiten durch Strömungsbewegung (Blutstrom) sowie der Konzentration von fluoreszierenden Farbstoffen bzw. fluoreszenzmarkierten Molekülen in Lösung. Ihr Prinzip beruht auf der Messung lokaler Konzentrationsfluktuationen, deren Ursache in der Bewegung der Teilchen selbst liegt und die zu Fluktuationen der Fluoreszenzintensität führen (Abbildung 2). Dazu wird ein Laserstrahl in den Probenraum fokussiert, sodass ein Messvolumen von nur wenigen Femtolitern Größe entsteht. Der Fokus des Laserstrahls kann durch eine dreidimensionale Gaussverteilung der Intensität (3D-Gauss) mit einer typischen Halbachsenlänge w (1/e2-Abfall der Intensität) von 200 – 400 nm in xy- und 800 – 1200 nm in z-Richtung angenähert werden. Durchquert nun ein Farbstoffmolekül dieses Volumen, wird es zur Fluoreszenz angeregt (Abbildung 2 (a)) – es kommt zu einem temporären Anstieg der Fluoreszenzintensität, einem sogenannten „Photonen-hurst“. Die Breite eines solchen ,hurst‘ gibt in etwa den Zeitraum wieder, während dem sich das Teilchen im konfokalen Volumen befunden hat (Abbildung 2 (b)). Der Zeitverlauf der Intensität I(t), der auch als Intensitäts-Zeitspur bezeichnet wird, wird über einen ausreichend langen Zeitraum aufgenommen, die dann mit Hilfe der Autokorrelationsfunktion G(T) analysiert wird:

ABBILDUNG 2. (A) PRINZIP DER FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE. FARB­STOFFE WERDEN IN EINEM SEHR KLEINEN VOLUMEN ZUR FLUORESZENZ ANGEREGT. (B) DIE PASSAGE DES FARBSTOFFS FÜHRT ZU PHOTONEN-‚BURSTS‘ DEREN BREITE DIE AUF­ENTHALTSDAUER IM VOLUMEN WIEDERGIBT. (C) DIE AUTOKORRELATION DER GESAMTEN FLUORESZENZ-ZEITSPUR LIEFERT EINE MITTLERE AUFENTHALTSDAUER ODER DIFFUSIONS­ZEIT -R_D, DIE MIT DEM DIFFUSIONSKOEFFIZIENTEN VERKNÜPFT IST.

Im Fall freier Brownscher Molekularbewegung erhält man als Korrelationsfunktion:

wobei ‚D‘ die so genannte Diffusionszeit, ein Maß für die Aufenthaltszeit der Moleküle im Fokus ist, während der Strukturfaktor S das Verhältnis aus Breite und Länge des Fokus‘ ist. Bei bekannter Größe des konfokalen Volumens lässt sich dann der Diffusionskoeffizient und, falls zusätzlich gerichtete Bewegung vorliegt, die Translationsgeschwindigkeit (Konvektion) bestimmen. Die Zahl der Moleküle im konfokalen Volumen N und damit die Konzentration der Fluorophore ist reziprok proportional zur Amplitude der Korrelationsfunktion G(0)-1=1/N.

Die Bewegung von Teilchen in der Nähe und an der Oberfläche von Gefäßwänden ist anisotrop, und der Blutfluss im Gefäß führt zu einem zusätzlich gerichteten Transport. Zur Erfassung der Anisotropie der Diffusion sowie der gerichteten Bewegung schlagen wir eine neue Form der FCS vor, die Multifokus-FCS, bei der bis zu vier konfokale Volumina simultan beobachtet werden. Ein weiterer Vorteil der Multifokus-FCS ist, dass Abweichungen der Form des konfokalen Volumens von der Modellannahme eines 3D-Gauss, z.B. durch die Fokussierung des Laserstrahls durch biologische Strukturen hindurch, das Messergebnis nicht signifikant beeinflussen. Die Fluktuationen der Fluoreszenz in den verschiedenen konfokalen Volumina kann jetzt nicht nur mit einer jeweiligen Autokorrelationsfunktion erfolgen, sondern zusätzlich durch entsprechende Kreuzkorrelationen

von je zwei Fluoreszenz-Zeitspuren I_m und I_n aus jeweils unterschiedlichen Fokussen. Diese Kreuzkorrelationen hängen nun nicht mehr nur von der Größe und Form der konfokalen Volumen ab sondern insbesondere von der relativen Position der beiden Fokusse. Diese Kreuzkorrelation ist besonders empfindlich auf eine gerichtete Komponente in der Bewegung der Teilchen.
Wir demonstrieren die Multifokus-FCS zunächst anhand zweier konfokaler Volumina 1 und 2 mit Abstand 01,2 (Abbildung 2 a). Eine gerichtete Bewegung mit der Geschwindigkeit V0 in Richtung von 01,2 realisieren wir, indem wir beide Fokusse simultan mit dieser Geschwindigkeit mit Hilfe eines Scan­Spiegels in der Probe bewegen. Diese Bewegung führt in der Vorwärts-Kreuzkorrelation CC12 zu einem erhöhten Wert bei T = TF (Abbildung 1 c), der mittleren Flusszeit, die analog zur Diffusionszeit angibt, wie lange ein Teilchen im Mittel per Konvektion gebraucht hat, um von dem ersten Volumen zum zweiten zu gelangen. Man kann diesen erhöhten Wert der Kreuzkorrelationsfunktion so interpretieren, dass nach einer Zeitspanne von M=TF die Wahrscheinlichkeit steigt, im Kanal 2 ein Photon zu detektieren, wenn zuvor ein Photon in Kanal 1 detektiert wurde – ein Ereignis, dass eben durch eine gerichtete Bewegung der Fluorophore zu erklären ist. In der Rückwärts­Korrelation CC21 findet man entsprechend bei T=TF einen erniedrigten Wert der Kreuzkorrelation. Eine Differenz beider Kreuzkorrelationen zeigt also einen Teilchenstrom in Richtung der Verbindung beider Volumen an. Eine Anpassung der aus der Messung erhaltenen Auto/Kreuz-Korrelationsfunktionen mit den entsprechenden Modellfunktionen (aufgrund der Komplexität hier nicht gezeigt) liefert als Parameter die Fließgeschwindigkeit, die im Rahmen der Messgenauigkeit mit der eingestellten Scan-Geschwindigkeit übereinstimmt.

Wäre die Fließgeschwindigkeit orthogonal zum Verbindungs­vektor der beiden Volumen, gäbe es keine Differenz in den beiden Kreuzkorrelationen (Abbildung 2 b), da die Fluorophore in diesem Fall ausschließlich aufgrund der ungerichteten Diffusion vom ersten Volumen in das zweite gelangen. Für den allgemeinen dreidimensionalen Fall sind insgesamt vier Fokusse nötig, um einen beliebig orientierten Fluss eindeutig zu bestimmen.

ABBILDUNG 3. MULTI-FOKUS-FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKTROSKOPIE. (A) ZWEI MESSVOLUMEN L UND 2 MIT ABSTAND 61,2 ERMÖGLICHEN DIE BESTIMMUNG DER RICHTUNG DES FLUSSES V0. (B) MESSUNG OHNE GERICHTETE BEWEGUNG, BEIDE KREUZKORRELATIONEN SIND IDENTISCH. (C): DER FLUSS FÜHRT ZU EINER DIFFERENZ ZWISCHEN DER VORWÄRTS- BZW. RÜCKWÄRTSKORRELATION CC12 UND CC21. DAS VORZEICHEN DIESER DIFFERENZ GIBT DIE RICHTUNG DES FLUSSES AN. ZUR EINDEUTIGE BESTIMMUNG EINER ZWEIDIMENSIONALEN GESCHWINDIGKEIT SIND ALLERDINGS DREI FOKUSSE NÖTIG. PUNKTE: KORRELATIONSDATEN, DURCHGEZOGENE LINIEN: ANPAS­SUNGSFUNKTIONEN MIT DIFFUSIONSKOEFFIZIENT UND FLIESSGESCHWINDIGKEIT ALS ANPASSUNGSPARAMETER.

Da eine in-vivo Messung direkt an einer Kapillarwand mit extremem Aufwand und vielen möglichen Schwierigkeiten verbunden ist, haben wir uns zunächst für ein in-vitro Model der Kapillarwand entschieden (Abbildung 4).

ABBILDUNG 4. MESSZELLE / KAPILLARMODELL. DAS MODELL BESTEHT AUS EINEM OPTI­SCHEN MIKROFLUIDIK-KANAL, IN DEM ENDOTHELZELLEN ANGESIEDELT WERDEN. EINE SPRITZENPUMPE ERLAUBT DIE MESSUNG UNTER STRÖMUNGSBEDINGUNGEN.
DIESES MODELL BESTEHT AUS ENDOTHELZELLEN DIE IN EINEM SPEZIELL DAFÜR ANGEFERTIGTEN MIKROFLUIDIK-KANAL HERANGEZOGEN WERDEN. ÜBER ZWEI ZUGÄNGE LÄSST SICH DIE PROBENLÖSUNG MIT DEN FARBSTOFFEN ZUFÜHREN. AUSSERDEM KANN MITHILFE EINER SPRITZENPUMPE DER BLUTFUSS SIMULIERT WERDEN.

Um zunächst dieses Modellsystem zu testen, haben wir in unseren ersten Messungen den Farbstoff Alexa 488 genutzt und mit nur einem Fokus gemessen. Da die Position und Ausdehnung der ESL nicht ohne weiteres genau bestimmbar ist, kommt zunächst ein z-Scan zum Einsatz: Der Fokus wird über mehrere Mikrometer entlang der optischen Achse mit konstanter Geschwindigkeit verschoben. Die Geschwindigkeit wird dabei so gewählt, dass sie sich nicht auf den Zeitbereich der Korrelationsfunktion auswirkt, in dem die Dynamik der zu untersuchenden Prozesse stattfindet. Die aufgezeichneten Daten werden nach der Messung einzelnen Schichten zugeordnet und getrennt voneinander ausgewertet.

In Abbildung 5 sind die Ergebnisse einer solchen Messung dargestellt. Der Scanbereich geht über eine Länge von sechs Mikrometern und ist in sechs Schichten LO bis 15 eingeteilt. Für jede Schicht wurde jeweils die Autokorrelationsfunktion berechnet (Abbildung 5 b). Ihre Amplituden nehmen von 0,7 für 15 bis O für LO ab. Dabei sind drei Gruppen aus je zwei Korrelationskurven erkennbar: 15 und 14 können als Ergebnisse für die freie Diffusion des Farbstoffs oberhalb der ESL betrachtet werden. Für 13 und 12 ist die Korrelationsamplitude reduziert, was auf eine erhöhte Farbstoffkonzentration in der ESL hindeuten kann. Eine alternative Erklärung könnte ein erhöhtes Hintergrundsignal an der ESL bzw. auch die teilweise Abdeckung des konfokalen Volumens im Deckglas sein. Für 12 ist eine Schwingung für größere T erkennbar, die der Frequenz der Fokusbewegung entspricht, und so auf Intensitätsänderungen durch die auf- und ab-Bewegungen des Fokus hindeutet. Ab 12 sind die Korrelationen mit dem Model nicht mehr sinnvoll auszuwerten, was dadurch zu erklären ist, dass der Fokus vollständig im Deckglas bleibt und somit keine Fluoreszenz der sich bewegenden Fluorophore mehr zu detektieren ist. Die Diffusionskoeffizienten, die sich aus den Ausgleichsrechnungen für die Schichten L5 bis L3 ergeben, entsprechen für L5 und L4 dem Literaturwert des Farbstoffs für freie Diffusion. Für L3 ist der Diffusionskoeffizient hingegen reduziert, was auf eine durch die ESL beschränkte Diffusion des Farbstoffs hindeutet, aber auch durch ein Vergrößern des Fokusvolumens aufgrund von Abbildungsfehlern in der Nähe des Deckglases hervorgerufen sein kann. Hier sind Kontrollmessungen notwendig.

ABBILDUNG 5. ERSTE MESSUNGEN DER DYNAMIK VON FARBSTOFFEN MIT EINEM FOKUS AM KAPILLARMODELL. (A): EIN Z-SCAN WURDE DURCHGEFÜHRT, DA DIE LAGE UND AUS­DEHNUNG DER ESL NUR SCHWER ZU BESTIMMEN SIND. DIE SO ERHALTENEN FLUORESZENZ-ZEITSPUREN AUS SECHS SCHICHTEN 15 BIS LO ENTLANG DER OPTISCHEN ACHSE WURDEN GETRENNT AUSGEWERTET. (B): DIE AMPLITUDE DER AUTOKORRELATION NIMMT MIT ANNÄHERUNG AN DIE ESL AB (15 – 12) UND VERSCHWINDET SCHLIESSLICH FÜR SCHICHTEN UNTERHALB DER ESL (12 – LO). (C): DER DIFFUSIONSKOEFLIZIENT DES FARBSTOFFS ENTSPRICHT FÜR DIE ERSTEN BEIDEN SCHICHTEN 15 UND L4 DEM LITERATURWERT FÜR FREIE DIFFUSION. FÜR DIE SCHICHT 13 NAHE DER ESL WURDE EIN REDUZIERTER DIFFUSIONSKOEFLIZIENT GEFUNDEN, DER EINE BESCHRÄNKUNG DER DIFFUSION DURCH DIE ESL VERMUTEN LÄSST. DIE MESSDATEN DER SCHICHTEN 12-LO LIESSEN SICH MIT DEM HIER GENUTZTEN MODELL NICHT SINNVOLL AUSWERTEN

Wir haben mit der Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie eine Methode, die uns das genaue Messen von Diffusion, Konvektion und Konzentration von Blutbestandteilen auf Einzelmolekül-Ebene erlaubt. Durch unsere Variante der Multi-Fokus-PCS können wir auch gerichtete Bewegungen auflösen und steigern die Robustheit des Messaufbaus gegenüber optischen Unregelmäßigkeiten. Erste Messungen an Endothelzellen bestätigen die Anwendbarkeit der Methode auf unser Modellsystem.

In den nächsten Schritten werden wir das Kapillarmodell weiter verfeinern und einen Konzentrationgradienten des Blutplasmas bzw. der zu untersuchenden Moleküle über die Endothelzellschicht mithilfe eines Zwei-Kammer-Systems einführen. Anschließend sollen auch Bestandteile des Blutplasmas sowie Wirkstoffe in ihrem Bewegungsverhalten an der ESL, auch bei imitiertem Blutstrom, untersucht werden.

Danksagung

Die vorliegende Publikation entstand im Rahmen des vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Forschungskollegs LUMEN (FKZ 13EZ1140A/B). LUMEN ist ein gemeinsames Forschungsprojekt der Fach­hochschule Lübeck und der Universität zu Lübeck und ist ein eigener Forschungszweig der Graduiertenschule für Informatik in Medizin und Lebenswissenschaften der Universität zu Lübeck.

Literatur

[1] D. Chappell, M. Jacob, B. F. Becker, K. Hofmann-Kiefer, P. Conzen and M. Rehm: Expedition glycocalyx. A newly discovered „Great Barrier ReeC Anaesthesist, vol. 57, no. 10, pp. 959-969, Oct. 2008
[2] S. Reitsma, D. W Slaaf, H. Vink, Marc A. M. J. van Zandvoort and Mirjam G. A. oude Egbrink: Tue endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization, Pflugers Arch., vol. 454. no. 3,pp. 345-359,Jun. 2007
[3] A. R. Pries, T. W Secomb and P. Gaehtgens: Tue endothelial surface layer, Pflugers Arch., vol. 440, no. 5, pp. 653-666, Sep. 2000

Autoren

Lars Kreutzburg, M.Sc.
Universität zu Lübeck, Institut für Physik
(korrespondierender Autor)
Universität zu Lübeck
Graduate School for Computing in Medicine and Life Sciences
Ratzeburger Allee 160
23562 Lübeck
E-Mail: kreutzburg(at)physik.uni-luebeck.de

Vit Dolezal, M.Sc.
Universität zu Lübeck
Institut für Physik

Prof. Dr. rer. nat. Christian Hübner
Universität zu Lübeck
Institut für Physik

 

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